HL-60人早幼粒白急性血病細(xì)胞

 細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)問(wèn)題解答
 
       細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)解答
 培養(yǎng)基生產(chǎn)和使用常見(jiàn)問(wèn)題
1.低血清培養(yǎng)基能用肉眼判斷其pH值嗎？
   答：低血清培養(yǎng)基中酚紅的含量與普通培養(yǎng)基中的酚紅含量不同，不能通過(guò)肉眼觀察或通過(guò)經(jīng)驗(yàn)來(lái)判定pH值，建議使用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。
2.低血清培養(yǎng)基的緩沖系統(tǒng)是什么？
   答：平衡鹽一般是由無(wú)機(jī)鹽及葡萄糖組成的。平衡鹽有Hanks′系統(tǒng)、Earle′s系統(tǒng)、Dulbecco′s磷酸緩沖鹽系統(tǒng)等。199系列培養(yǎng)基、MEM系列培養(yǎng)基均有Hanks′系統(tǒng)的培養(yǎng)基及Earle′s系統(tǒng)的培養(yǎng)基。但是有些培養(yǎng)基均不是以上常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，例如RPMI 1640培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基。MEM(SLM)低血清培養(yǎng)基的平衡鹽系統(tǒng)也不是常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，該平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力強(qiáng)于常規(guī)平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力。
3.谷氨酰胺溶液和碳酸氫鈉的配制方法是什么？
   答：以0.2mol/L的 L-谷氨酰胺配制為例：稱(chēng)取L-谷氨酰胺2.92g，加注射用水100ml，充分?jǐn)嚢杌靹?。?.2μm濾膜正壓過(guò)濾除菌。溶液應(yīng)在4℃下避光保存，2周內(nèi)使用。以7.5% NaHCO3的配制為例：稱(chēng)取NaHCO37.5g溶于100ml蒸餾水中過(guò)濾除菌。
4.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
   答：酚紅在培養(yǎng)基中用作pH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。酚紅本身對(duì)生物制品質(zhì)量并不會(huì)產(chǎn)生影響，可以通過(guò)純化技術(shù)去除，但酚紅在無(wú)血清培養(yǎng)基可能帶來(lái)胞內(nèi)鈉/鉀失衡，影響細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)然這種作用能被血清所中和或減輕。酚紅并不是培養(yǎng)基中必需的一種成分，很多國(guó)外的疫苗或抗體生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中都使用無(wú)酚紅培養(yǎng)基。
5.放置在冰箱中的培養(yǎng)基顏色會(huì)發(fā)生變化，為什么？
 
     答：培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中酸堿指示劑(通常為phenol red)的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿后再用于細(xì)胞培養(yǎng)將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無(wú)菌過(guò)濾的CO2，以調(diào)整pH值。
6.無(wú)血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？
    答：當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。因?yàn)檠逯械牡鞍讜?huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。而在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活。
7.培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長(zhǎng)期保存嗎？
    答：一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解。
8.什么是個(gè)性化培養(yǎng)基？它有什么優(yōu)點(diǎn)？
    答：根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型、培養(yǎng)方式和生產(chǎn)工藝等特點(diǎn)所定制的培養(yǎng)基，即個(gè)性化培養(yǎng)基。個(gè)性化培養(yǎng)基在國(guó)外生物制藥企業(yè)被普遍采用，個(gè)性化培養(yǎng)基可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速率、培養(yǎng)密度、以及延長(zhǎng)細(xì)胞維持時(shí)間；也可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供均衡的營(yíng)養(yǎng)供給，減少細(xì)胞有害代謝物質(zhì)的積累，降低對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的危害；同時(shí)對(duì)貼壁細(xì)胞而言，能增加細(xì)胞的貼壁性，并降低培養(yǎng)過(guò)程中剪切力對(duì)細(xì)胞的損傷；個(gè)性化培養(yǎng)基可以根據(jù)各戶(hù)的特殊需求減少或不使用動(dòng)物源成分，從而使生物制品安全性更有保障。
9.細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？
    答：如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應(yīng)該自然溶解培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒(méi)有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。
10.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？
    答：動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10%DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95%原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意：由于DMSO稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。
11.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎？
    答：大部分添加物和試劑最多可以?xún)鋈?次，如果次數(shù)過(guò)多會(huì)將使含有的蛋發(fā)生降解和沉淀，這將會(huì)影響它的性能。
12.液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好？還是冷凍好？
    答：要冷藏?。⊥ǔＲ后w培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個(gè)月到一年。

HL-60人早幼粒白急性血病細(xì)胞
貼壁細(xì)胞接收后的操作流程與注意事項(xiàng)
1.收到細(xì)胞當(dāng)天盡快更換新鮮*培養(yǎng)基，第二天再進(jìn)行消化處理
2.如果細(xì)胞收到時(shí)呈懸浮或者部分懸浮的狀態(tài)，請(qǐng)將懸浮的細(xì)胞即時(shí)離心，加15%血清的*培養(yǎng)基到新的培養(yǎng)皿/瓶繼續(xù)培養(yǎng)觀察。同時(shí)原培養(yǎng)瓶中剩下的貼壁細(xì)胞更換為15%血清的*培養(yǎng)基，培養(yǎng)觀察
3.若出現(xiàn)生長(zhǎng)不均：貼壁細(xì)胞若出現(xiàn)分布不均，成島狀生長(zhǎng)，可將細(xì)胞進(jìn)行消化，重懸打散細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)

貼壁細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)傳代流程（請(qǐng)嚴(yán)格遵照無(wú)菌操作）
1.吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，加適量0.25%胰酶進(jìn)行消化細(xì)胞（注意把握消化時(shí)間）
2.鏡下觀察消化情況，在細(xì)胞邊緣縮小，貼壁松動(dòng)時(shí)（不建議消化到細(xì)胞漂?。┤サ粢让?，加6~8ml *培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，盡量把細(xì)胞層吹落，吹散
3.取部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿/瓶中，添加適當(dāng)?shù)?培養(yǎng)基，把細(xì)胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
4.注意培養(yǎng)基PH值變化情況，定期換液（每周2-3次），待細(xì)胞密度達(dá)到80%以后重復(fù)1項(xiàng)作或者凍存