NCI-H747人盲腸癌細(xì)胞

1、您收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作：

取出25cm²培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮*培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。

2、細(xì)胞傳代：

1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm²培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；

3）棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml*培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代，*后放入37℃，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）待細(xì)胞*貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。

3、細(xì)胞凍存：

1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm²培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；

3）用適量的凍存液（FBS：DMSO=9 ：1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；

4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過(guò)夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。 

4、細(xì)胞復(fù)蘇：
1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具），快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無(wú)結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2）將凍存管中的細(xì)胞移至含5ml*培養(yǎng)基的15ml離心管中， 1000rpm離心5min；

3）棄上清，沉淀用5ml*培養(yǎng)基重懸，接種25cm²培養(yǎng)瓶，于37℃，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）第二天，換用新鮮*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞處理方法：

一、貼壁細(xì)胞

1、 接收到細(xì)胞，肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收到時(shí)的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時(shí)的細(xì)胞 100X,200X 各一張）。

2、用 75%的酒精消毒外包裝,在超凈工作臺(tái)內(nèi)打開(kāi)外包裝。

3、嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作規(guī)范，打開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

4、37度平衡1-2小時(shí)。

5、用移液管吸取培養(yǎng)基，到50ml離心管中，剩下細(xì)胞密度達(dá)到80%至90%可以傳代，如沒(méi)有達(dá)到添加6ml新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

6、如果肉眼檢查上清有細(xì)胞，對(duì)50ml上清進(jìn)行離心收集細(xì)胞，如果細(xì)胞連片狀態(tài)，棄掉上清對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化（1ml胰酶37度），接種培養(yǎng)。

二、懸浮細(xì)胞

1、接收到細(xì)胞，肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收到時(shí)的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時(shí)的細(xì)胞 100X,200X 各一張）。

2、用 75%的酒精消毒外包裝,在超凈工作臺(tái)內(nèi)打開(kāi)外包裝。

3、嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作規(guī)范，打開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

4、細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基用吸管*吸出（嚴(yán)禁直接傾倒）。

5、1000rpm，5min 離心，用吸管小心吸出上清，加入培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞。

6、將重懸好的細(xì)胞轉(zhuǎn)入六孔板或者細(xì)胞培養(yǎng)瓶種，加入新鮮培養(yǎng)基，置于 37℃，5%CO2 培養(yǎng)（大部分細(xì)胞）。

培養(yǎng)操作：細(xì)胞培養(yǎng)操作指南

細(xì)胞常見(jiàn)問(wèn)題分析：細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題分析

細(xì)胞在發(fā)貨前進(jìn)行質(zhì)檢：

1、細(xì)胞存種的活性檢測(cè)

2、細(xì)菌、真菌、霉菌污染物鏡檢

3、衣原體、支原體檢測(cè)（熒光法、培養(yǎng)法等）

產(chǎn)品質(zhì)量保證及售后：

1、 細(xì)胞為三代以內(nèi)，活體。運(yùn)輸過(guò)程中細(xì)胞出現(xiàn)污染和狀態(tài)不好，我們*免費(fèi)重新發(fā)貨。

2、 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中若確定是客戶問(wèn)題，客戶僅需支付物流和耗材費(fèi)用，我們可重新發(fā)貨。其他根據(jù)情況靈活處理。

3、 產(chǎn)品使用過(guò)程中，可提供技術(shù)上的指導(dǎo)。

NCI-H747人盲腸癌細(xì)胞

一，燒瓶培養(yǎng)的處理程序

在培養(yǎng)瓶中接種細(xì)胞并在培養(yǎng)基中*填充培養(yǎng)基以防止運(yùn)輸過(guò)程中細(xì)胞的丟失。

1、收到后，目視檢查培養(yǎng)物是否有微生物污染的宏觀證據(jù)。

使用倒置顯微鏡（配備有相位傳感器），仔細(xì)檢查是否有微生物污染的證據(jù)。還檢查以確定大多數(shù)細(xì)胞是否仍然附著在燒瓶底部？在運(yùn)輸過(guò)程中，培養(yǎng)物有時(shí)被粗略地處理，并且許多細(xì)胞經(jīng)常分離并懸浮在培養(yǎng)基中（但仍然是可行的）。

2、如果細(xì)胞仍然附著，無(wú)菌去除5至10毫升的運(yùn)輸介質(zhì)。可以節(jié)省運(yùn)輸媒介以重復(fù)使用。在5%℃的空氣中，在37℃下培養(yǎng)細(xì)胞，直到它們準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)BGC-823人胃腺癌細(xì)胞（低分化）沒(méi)有附著，無(wú)菌地移除燒瓶的全部?jī)?nèi)容物，并以1000rpm離心5至10分鐘。取出運(yùn)輸介質(zhì)并保存。在10毫升這種培養(yǎng)基中重新沉淀顆粒細(xì)胞并加入25厘米的燒瓶中。在空氣中5%℃下，在37℃下孵育，直至細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

二、傳代程序

體積為75厘米的燒瓶。增加或減少其他尺寸培養(yǎng)容器所需的分離培養(yǎng)基的量。

1、去除和丟棄培養(yǎng)基。

2.用0.25%(w/v)胰蛋白酶0.53mM EDTA溶液沖洗細(xì)胞層，除去所有含有胰蛋白酶抑制劑的血清痕跡。

3.添加2.0~3.0 ml胰酶-EDTA溶液瓶中，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞到細(xì)胞層分散（取決于胰蛋白酶的批）。

注意：為了避免結(jié)塊，不要在擊打或搖晃瓶子時(shí)攪拌細(xì)胞，等待細(xì)胞分離。難以分離的細(xì)胞可以放置在37°C以促進(jìn)擴(kuò)散。

4、加入6～8毫升的完整生長(zhǎng)培養(yǎng)基，輕輕吸液，抽吸細(xì)胞。

5、在新培養(yǎng)容器中加入適當(dāng)?shù)募?xì)胞懸液等分試樣。

6、培養(yǎng)37°C培養(yǎng)基。

推薦栽培比為1:3∶1:4。

介質(zhì)更新：每周2至3次

三、冷凍保存程序

該協(xié)議使用量在75平方厘米的瓶；比例減少或增加的其他尺寸的分離介質(zhì)的培養(yǎng)容器的數(shù)量。

1、去除和丟棄培養(yǎng)基。

2。簡(jiǎn)要沖洗細(xì)胞層0.25（w/v）trypsin0.53mm EDTA溶液去除所有痕跡血清含有胰蛋白酶抑制劑。

3。加入2至3毫升的胰蛋白酶-EDTA溶液瓶中，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞到細(xì)胞層是分散的（通常在1到10分鐘）。

注意：為了避免結(jié)塊，不要在擊打或搖晃瓶子時(shí)攪拌細(xì)胞，等待細(xì)胞分離。難以分離的細(xì)胞可以放置在37°C以促進(jìn)擴(kuò)散。

4、加入6～8毫升的完整生長(zhǎng)培養(yǎng)基，輕輕吸液，抽吸細(xì)胞。

5。去除胰酶EDTA溶液，將細(xì)胞懸液到離心管和旋轉(zhuǎn)約5 1000rpmfor 10分鐘。

6、低溫保存培養(yǎng)液中的上清液和復(fù)蘇細(xì)胞。

7、將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低溫瓶，1ml／瓶。

8、低溫容器中的細(xì)胞Frozen（NalgENα5100-01）。